Er studierte an der Universität Breslau (Abschluss Dr. phil. 1899) sowie am dortigen Jüdisch-Theologischen Seminar. Von 1891 bis 1906 war er Rabbiner in Göttingen, anschließend von 1906 bis zur Pensionierung 1929 in Dortmund. Danach zog er 1932 nach Hamburg um und widmete sich weiterhin der Exegese. 1939 floh er vor den Nationalsozialisten nach London.
Obwohl er nicht zur Orthodoxie gerechnet werden kann, standen die Schlussfolgerungen aus seinen Textstudien in völligem Widerspruch zur neuzeitlichen (christlich geprägten) Bibelkritik. Seiner Meinung nach war der traditionelle Text zuverlässiger als die alten Übersetzungen, und die willkürlichen Textkorrekturen der Bibelkritik hielt er für unwissenschaftlich, weil ihr einziger Zweck in der Bestätigung deren eigener Voraussetzungen lag. Außerdem beschuldigte er die Vertreter der Bibelkritik, antisemitische Vorstellungen und Vorurteile gegen das Judentum zu pflegen. Seine Ansichten veröffentlichte er in Der Pentateuch, exegetisch-kritische Forschungen und Quellenscheidung und Exegese im Pentateuch.
Sein wichtigstes exegetisches Werk ist Das erste Buch der Tora: Genesis, übersetzt und erklärt. Jacob akzeptierte weder Moses Autorschaft des Pentateuchs noch die Idee der Verbalinspiration, fand aber im Aufbau der Thora so viel literarische Einheit und geistige Harmonie, dass jegliche Suche nach ihren "Quellen" ihm als nutzlose hypothetische Übung erschien.
Benno Jacob war Gründer der schlagenden und farbentragenden Studentenverbindung Viadrina im KC, einer jüdischen Verbindung, die 1886 in Breslau von jüdischen Studenten gegründet wurde, um den Antisemitismus an den Universitäten mit der Mensur zu bekämpfen. Er war ein Gegner des Zionismus nicht nur aufgrund seines Glaubens an eine deutsch-jüdische Synthese, sondern auch weil für ihn der Zionismus eine völlige Säkularisierung des Judentums und eine Grundlage für jüdischen Atheismus bedeutete.
Ein Enkel Jacobs ist der amerikanische Rabbiner Walter Jacob, Präsident des Abraham-Geiger-Kolleg Potsdam, Träger des Großen Bundesverdienstkreuzes und Komtur des Päpstlichen Gregoriusordens.