Sie stammte aus einer Schauspielerfamilie und debütierte ohne jegliche Schauspielausbildung[2] 1900 am Nuscha-Butze-Theater, dem späteren Theater am Schiffbauerdamm. Sie unternahm bald danach eine Tournee in die Niederlande und trat am Irving Place Theatre in New York auf.
Von 1907 bis 1925 gehörte sie dem Ensemble des Deutschen Theaters in Berlin unter Max Reinhardt an. Durch Robert Wiene kam sie zum Film und spielte anfangs wie beim Theater vorwiegend im Rollenfach der Salondame. Später verkörperte die etwas füllige Schauspielerin als Nebendarstellerin vorwiegend Tanten, Mütter, Nachbarinnen, Haushälterinnen, Zimmervermieterinnen und Wirtinnen. Auf diese Weise wirkte Margarete Kupfer in über 150 Stumm und Tonfilmen mit, zuletzt besonders in Rollen der komischen Alten. Daneben arbeitete sie auch für den Funk
Nach dem Zweiten Weltkrieg agierte sie wieder am Theater am Schiffbauerdamm. Für die ostdeutsche Filmproduktionsgesellschaft DEFA trat sie in zwei Filmproduktionen vor die Kamera, in Hans Deppes Nachkriegskomödie Kein Platz für Liebe (1947), sowie im Kriminalfilm Zugverkehr unregelmäßig (1951) unter der Regie von Erich Freund.[2] 1952 erhielt sie den Nationalpreis der DDR.