Eberhard von Rothkirch entstammte einem schlesischen Adelsgeschlecht. Er wurde als viertes Kind der evangelischen Eltern Oskar Siegismund von Rothkirch und Panthen (* 19. Mai 1821) und Helene von Rosenberg geboren. Während des Besuches der Ritterakademie in Liegnitz lernte er Eduard von Pückler kennen. Er nahm als Unteroffizier am Deutsch-Französischen Krieg teil. Eine schwere Verwundung in der Schlacht von Sedan führte zur Amputation seines rechten Beines und beendete seine militärische Karriere. Vor seinem Abschied wurde er zum Offizier befördert und mit dem Eisernen Kreuz ausgezeichnet. Er studierte Forstwirtschaft in Eberswalde und war danach von 1878 bis 1896 als Forstbeamter bei der Berliner Hofkammer tätig. 1881 trat er als Helfer in die von Graf Andreas Bernstorff begründete Sonntagsschularbeit ein. Am 22. Januar 1883 gehörte er zusammen mit Eduard von Pückler, Andreas Graf von Bernstorff und Christian Phildius zu den Gründern des ersten Christlichen Vereins junger Männer in Berlin, dessen erster Präsident er wurde. Eberhard von Rothkirch gehörte als Initiator zum Gründungskreis der Gemeinschaftsbewegung in Deutschland