Nach ihrer Schauspielausbildung an der Max-Reinhardt-Schule des Deutschen Theaters Berlin gab Charlotte Witthauer 1932 ihr Bühnendebüt am Stadttheater Oberhausen, wo sie auch ihr erstes festes Engagement erhielt. Es folgten Bühnenstationen am Stadttheater Rostock sowie am Landestheater Braunschweig. Von 1936 bis 1944 gehörte sie zum Ensemble des Berliner Staatstheaters. Nach Kriegsende folgten Engagements in Hamburg (Deutsches Schauspielhaus) und München (Kleine Komödie).
1931 gab Charlotte Witthauer im Drama Mädchen in Uniform ihr Spielfilmdebüt. In den folgenden Jahren spielte sie meist Nebenrollen in bekannten Produktionen wie Feuerwerk (neben Lilli Palmer). Zweimal verkörperte sie die Frau des Gymnasiumdirektors Dr. Taft (Theo Lingen) in der Filmserie Die Lümmel von der ersten Bank.
Darüber hinaus arbeitete sie umfangreich als Sprecherin beim Hörfunk sowie seit den vierziger Jahren als Synchronsprecherin. Schon im Jahre 1934 konnte man sie neben Gustaf Gründgens, Theo Lingen und Lola Müthel in Hans Sonnenstössers Höllenfahrt erleben. 1949 war sie neben Heinz Rühmann, Elfriede Kuzmany und Grethe Weiser in der Komödie Du kannst mir viel erzählen im Einsatz. In Thornton Wilders Wir sind noch einmal davongekommen war sie 1965 in einer Produktion des WDR und zwei Jahre später in einer Fassung des RIAS zu hören. In beiden Hörspielen waren Hans-Christian Blech, Elfriede Irrall und Almut Eggert Ihre Partner.
Charlotte Witthauer war mit dem Schauspieler Hans Quest von 1940 bis 1968 verheiratet. Aus dieser Ehe stammen die beiden Söhne Christoph (* 1940, Schauspieler) und Thomas Quest (* 1945, Firmeninhaber). Sie ist auf dem Starnberger Friedhof beerdigt.