Karel Purkyně war der Sohn des berühmten Physiologen Jan Evangelista Purkyně. Er wurde in Breslau geboren, weil sein Vater zu dieser Zeit dort an der Universität lehrte. Er studierte ab 1851 an der Akademie der Bildenden Künste Prag und ging von 1854 bis 1855 nach München an die Privatschule von Johann Baptist Berdellé. Ende 1856 absolvierte er einen einjährigen Studienaufenthalt in Paris, wo er das Atelier von Thomas Couture besuchte, sich aber hauptsächlich dem Studium der alten Meister im Louvre widmete. Zwischen 1858 und 1862 beteiligte sich Purkyně regelmäßig an den Prager Jahresausstellungen.

 Er studierte 1861 kurze Zeit in Wien bei Carl Rahl und hielt sich 1865 nochmals in München auf. Ab 1862 wirkte er auch als Kunstkritiker für tschechisch- und deutschsprachige Zeitschriften. Purkyně wurde nach seinem frühen Tod auf dem Vyšehrader Friedhof in Prag bestattet.